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包志明，潘继伦，吴晨，俞耀庭(南开大学分子生物学研究所，生物活性材料教育部重点实验室, 天津300071)The preparation and characterization of porous galactosylated chitosan scaffoldsBAO Zhi-ming, PAN Ji-lun, WU Chen, YU Yao-ting(The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract：The numbers and the function of the hepatocytes in the bioartificial liver device is the key point determining the efficiency of the substitution of the crocked up liver. Another point in close relationship to this question is the perfection of the structure and the performance of porous scaffolds. The highly porous chitosan scaffold with porosity above 90% and the average pore diameter 100~200µm are prepared by lyophilization. The materials have been modificated by galatose whose specific ligand for asialoglycoprotein receptor in hepatocytes. The scaffolds provided a favorable circumstance for the culturing of hepatocytes and it’s density in the materials reached to a very high level. Our research provided a porous scaffold of good performance for culturing high density hepatocytes.Key words：chitosan；galatose；lyophilization；bioartifical liver摘要：生物人工肝反应器中肝细胞的数量和功能是能否有效替代已衰竭肝脏功能的关键，与此紧密相关的是细胞支架材料结构和性能的优化。采用冷冻干燥法，制备了大孔壳聚糖支架，孔隙率在90%以上，平均孔径在100~200µm之间。以肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特异性配体--半乳糖，对材料表面进行糖基化修饰，制备了半乳糖基修饰的大孔壳聚糖支架，肝细胞在其上生长状况良好，细胞培养密度高，为高密度培养肝细胞提供了一种性能优良的支架材料。关键词：壳聚糖；半乳糖；冷冻干燥法；生物人工肝中图分类号：O636 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊-2454-031 引言 杂化人工肝支持系统是近30年来发展起来的对肝功能衰竭进行治疗的一种很有前景的方法[1]，但如何提高反应器内的肝细胞密度并维持其生理活性是一个关键问题，也是进一步发展人工肝所面临的主要任务之一[1,2]。壳聚糖(chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物，是一种兼具生物相容性和生物可降解性的晶形高分子材料[3,4]，而半乳糖则是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体[5]。本项研究中，我们尝试以半乳糖对壳聚糖进行糖基化修饰，并通过冷冻干燥法，制备三维支架，模拟肝细胞在体内生长的微环境，为肝细胞的接种、贴附、分化提供一种良好的载体材料。2 实验方法2.1 材料 壳聚糖，脱乙酰度90％，分子量120万，浙江省海洋生物化学有限公司；乳糖，A.R.，天津市化学试剂六厂；Wistar大鼠，200～250g，天津市军事医学科学研究院提供；Trypan Blue，上海化学试剂采购供应站；胶原酶IV，Sigma Chemical Co.Ltd；HEPES，北京鼎国生物技术发展中心；新生牛血清，联星生物技术有限公司；庆大霉素，天津金耀氨基酸有限公司2.2 壳聚糖大孔支架的制备 将壳聚糖溶于1%乙酸中配成1.5%(w/v)的壳聚糖/乙酸溶液，向六孔细胞培养板每孔中加入1mL，迅速盖好，4℃预冷3h，再置于－28℃冷冻过夜后冷冻干燥。以Matthew所述的方法[3]对壳聚糖支架进行水化，其后向六孔细胞培养板每孔加入浓度为36mg/mL的半乳糖溶液。反应2h后，加入过量的NaBH4，继续反应24h。用蒸馏水洗至中性，再用pH7.4的PBS浸洗3次，最后二次冷冻干燥。2.3 孔隙率测定 孔隙率的测定使用Shen F等提出的方法[6]，通过冷干前后支架重量的变化推算出孔隙率的大小。2.4 半乳糖基化反应程度的测定 半乳糖基化反应程度的测定，使用Park IK等提出的方法[7]，利用核磁共振图谱中的峰的面积来计算出半乳糖基化反应程度。2.5 原代大鼠肝细胞的分离与培养 选取250g左右雄性Wistar大白鼠，采用Seglen原位灌流法[8]，乙醚麻醉后开腹，门静脉插留滞针，先以不含钙离子的预灌流液(含8.3mg/mL NaCl，0.5mg/mL KCl，2.4mg/mL HEPES，pH=7.4)灌流10 min左右，冲出血细胞，再用含0.05%胶原酶的灌流液（预灌流液中加入5mmol/L CaCl2，0.05%胶原酶）灌流消化肝叶内细胞间质获得原代肝细胞。将细胞悬浮于基础WE培养基中，400rpm离心3次，每次2 min，最后再用WE完全培养基（基础培养基中加入10%小牛血清，0.2U/mL胰岛素，0.292mg/mL L-Gln，80U/mL庆大霉素）使细胞悬浮。台酚兰拒染法测定细胞存活率并计数，存活率在90%以上。 将细胞悬液吹匀后接种于灭菌的多孔支架上，六孔板每孔中接种1×106个细胞，于37℃ 5%CO2条件下静置培养。6 h后观察细胞贴附和生长情况，并更换新鲜培养基，以后每24 h更换50%的培养基，倒置相差显微镜观察培养肝细胞的形态。3 结果与讨论3.1 大孔支架的扫描电镜分析 大孔支架的制备采用冷冻干燥法。由支架的扫描电镜照片如图1所示，大孔壳聚糖支架孔径100～200μm，大孔支架的孔隙率在97%以上，支架内部孔隙互相贯通，有利于细胞营养物质和代谢产物的扩散。
3.2 糖基化支架的红外图谱分析 以半乳糖对壳聚糖进行修饰时，反应发生在半乳糖的醛基和壳聚糖的氨基之间。图2为大孔壳聚糖支架的红外图谱，其中A为壳聚糖、B为半乳糖基化壳聚糖。曲线A中的1599.1cm－1吸收峰是壳聚糖氨基特征峰。曲线B中，壳聚糖上氨基特征峰减弱，在1635.8cm－1处出现了新的吸收峰，为反应生成的希夫碱键（C=N）的特征吸收峰。3.3 糖基化支架的核磁图谱分析 图3为半乳糖基化壳聚糖的1H NMR谱。对于壳聚糖的－NH(C=O)CH3基，其甲基H的化学位移出现在2.0×10-6。3.3×10-6和4.9×10-6处的化学位移分别是壳聚糖分子主链上的H2和H1引起的。通过累加共振图谱中3.1×10-6~4.6×10-6（H2~H6）所有峰的面积S，计算出壳聚糖的糖基化度DS（Degree of Substitution）为51.8%。DS＝(S-6)/8。
3.4 肝细胞在支架上的生长状况 肝细胞接种以后，由于壳聚糖的亲水性质，大部分细胞进入支架的孔中。细胞最大的贴壁率为5.1×105个/孔。每个孔的体积以0.3cm3计算，则细胞最大的接种密度为1.7×106个/cm3。与未修饰的壳聚糖支架相比，半乳糖修饰后的壳聚糖支架上肝细胞密度较高，保持良好的球形，这表明肝细胞处于良好的生理状态。4 结论 利用冷冻干燥法制备的半乳糖基化的大孔壳聚糖支架，平均孔径在100~200µm之间，孔隙率在90%以上。以半乳糖对壳聚糖进行糖基化修饰，半乳糖基化度最高可达51.8%，将其用于肝细胞的培养时，可以很大程度的提高肝细胞培养密度并维持其生理活性。参考文献：[1] Hayes, Peter C. Lee, Alistair. What progress with artificial livers. [J]. The Lancet. 2001, 358(9290): 1286-1287.[2] Kaneko M, Fukuda J, Ijima H, et. al. Development of hybrid artificial liver support system using spheroid culture and application to warm ischemic liver failure in dog and pig as a preclinical test. [J]. Materials Science and Engineering: C. 1998, 6(4): 245-248.[3] Madihally SV, Matthew HWT. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering. [J]. Biomaterials, 1994, 20: 1133-42.[4] [4] Chandy F, Sharma P. Chitosan as a biomaterial. [J]. Biomater Artif Cells Artif Org, 1990, 18: 1-24.[5] Park TG. Perfusion culture of hepatocytes within galactose derivatized biodegradable poly (lactide-co-glycolide) sca- ffolds prepared by gas foaming of effervescent salts. [J]. J Biomed Mater Res, 2002, 59: 127-135.[6] Shen F, Cui YL, Yang LF, et al. A study on the fabrication of porous chitosan/gelatin network scaffold for tissue engineering. [J]. Polym Int, 2000, 49: 1596-1599.[7] Park IK, Yang J, Jeong HJ, et al. galactosylated chitosan as a synthetic extracellular matrix for hepatocytes attachment. [J]. Biomaterials. 2003, 24: 2331-2337.[8] Seglen PO. Preparetion of rat liver cells. [J]. Exp Cell Res. 1972, 74: 450-454.基金项目：天津市自然科学基金资助项目(033608011)作者简介：包志明（1979－），男，吉林长春人，硕士研究生，主要研究方向为组织工程，生物医用材料论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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