华理刘昌胜/屈雪、马里兰大学Gregory F. Payne AS：电分选策略构建组成/微结构双梯度Janus引导骨再生膜
在组成/结构上具备异质性特征的生物材料能够更灵活地定制局部特性，从而提供更为丰富的生物学功能，在医学领域的需求越来越大。受控的异质性（如梯度）是生物系统中的普遍特征，其中包括分子类型或浓度的空间变化与形态结构的空间变化，例如孔径和孔隙率。然而，目前能够集成组分和微结构梯度特征的生物材料制造技术仍然十分缺乏。
近期，华东理工刘昌胜院士/屈雪教授团队报道了一种电分选技术，利用壳聚糖与明胶分子的pH依赖的带电特性诱导二者在电场作用下的差异化电泳和自组装行为(即，在低pH条件下，壳聚糖与明胶分子均带正电，同时向阴极电泳；中间pH条件，明胶发生电荷反转，与带正电的壳聚糖发生静电相互作用；高pH条件，壳聚糖脱质子化自组装，而带负电的明胶分子被阴极排斥远离电极)，实现明胶/壳聚糖均相混合物的组成分选，从而构建具有成分梯度（即，从壳聚糖的富集层到明胶的富集层）和可调节的致密/多孔梯度结构（孔隙率、孔径以及致密层与多孔层的比率）的Janus薄膜，其在引导骨再生的应用中展示出多重功能：包括柔韧的机械性能，各向异性的界面润湿性、传质（定向生长因子释放）和差异化细胞调控（防止成纤维细胞浸润，促进成骨细胞生长和分化）等。总的来说，这项工作展示了电组装在梯度化功能生物材料定制方面的巨大潜力。具体成果以 “Electro-Sorting Create Heterogeneity: Constructing A Multifunctional Janus Film with Integrated Compositional and Microstructural Gradients for Guided Bone Regeneration”发表在《Advanced Science》上。
【材料设计思路、制备及应用】
电组装是一种新兴的增材制造方法，它利用施加的电信号（通常< 5 V）引导电极表面（或附近）的材料组装。电极施加的信号可以提供时空控制的线索来组装具有成分和微观结构控制的生物大分子材料。一方面，电场提供诱导带电生物大分子链向指定电极迁移的提示，从而选择性地从溶液中富集它们。另一方面，电极反应可以产生分子线索，可以诱导溶胶/凝胶转变并生成分层组装结构（例如，H2O2的阴极电解可以局部产生OH-离子），例如图1a展示的电信号触发的壳聚糖自组装过程。在这项工作中，他们发现电子输入可以“分选”明胶和壳聚糖的均匀双组分混合物，从而形成集成组分和微观结构梯度的Janus 薄膜。从组分上看，这种薄膜呈现出从富含壳聚糖的材料层到富含明胶的材料层的过渡。在结构上，这种薄膜呈现出从致密层到多孔层的梯度结构转变，如图1b所示。这项工作进一步证实了这种Janus薄膜在引导骨再生（GBR）中的多重功能：面对结缔组织的薄膜富含壳聚糖且致密，提供了足够的机械支撑，以防止薄膜塌陷并充当防止成纤维细胞侵入的屏障；面对骨缺损的薄膜富含明胶且多孔，为成骨细胞粘附、增殖和分化提供了适宜的微环境。此外，Janus薄膜的梯度结构赋予了薄膜柔韧的力学特性和各向异性的润湿性，使手术操作顺应性更高强。各向异性的多孔结构允许生长因子（BMP-2）的定向运输，进一步强化骨再生，如图1c所示。
图1. (a) 电信号的输入提供了控制壳聚糖电组装的两个线索：电解反应产生的pH线索诱导壳聚糖链去质子化和自组装；电场信号诱导阳离子壳聚糖链迁移。(b) 电子输入可以“分类”蛋白质明胶和多糖壳聚糖的均匀混合物，并提示具有成分和微观结构集成梯度的Janus薄膜的出现。(c) 具有梯度特征的Janus薄膜作用于结缔组织和骨之间的界面，使其在引导骨再生中发挥各种功能：富含壳聚糖的致密面提供机械支撑并且阻止成纤维细胞向内生长，而壳聚糖/明胶-多孔面促进成骨细胞生长和分化。
图2. 壳聚糖/明胶的均匀混合物的电分选机制以及Janus薄膜的组分与微结构梯度的动力学形成过程。(a) 沉积过程中不同区域内壳聚糖与明胶分子链的相互作用及电分选机制：在低pH条件，壳聚糖与明胶分子均带正电，互相排斥但同时向阴极电泳；中间pH条件，明胶发生电荷反转，与带正电的壳聚糖发生静电相互作用；高pH条件，壳聚糖脱质子化自组装，而带负电的明胶分子被阴极排斥。(b)壳聚糖和明胶（均为 0.1% w/v）及其等比例混合物的Zeta电位的pH依赖性。 (c) ITC测量揭示了中间pH状态下壳聚糖和明胶之间的吸热相互作用（pH约为5；琼脂用作非相互作用对照），以及 (d-e) 中间 pH 状态下壳聚糖和明胶之间吸热相互作用的比较pH (pH≈5) 和稍低的 pH (pH≈4) 表明相互作用随着pH的降低而减弱。(f) 高分辨率横截面荧光图像和相应的图像强度显示了薄膜的成分梯度。(g) ATR-FTIR光谱显示薄膜两个面之间的成分差异。流体通道内 (h) 壳聚糖/明胶混合物和 (i) 壳聚糖的动力学组装过程的原位观察。所得 (j) 明胶-壳聚糖膜两个表面和横截面的SEM图像及其光学外观。(l) 用于原位观察的流体通道装置示意图。
图3. Janus 壳聚糖/明胶薄膜的机械性能和表面润湿性。(a) 光学图像证明了Janus薄膜的柔韧性（壳聚糖/明胶比例为6/4；电组装参数为6.67 mA/cm2 1000秒）：湿膜可以扭曲（打结和解开成结），干膜可以折叠成紧凑的星形结构。(b)通过液滴对干膜的致密ElecFace或多孔SolcFace进行润湿。(c) 动态水接触角测量表明，多孔SolcFace促进液体扩散，而致密ElecFace则呈现疏水性。(d) 干膜的致密ElecFace和多孔SolcFace与湿猪皮表面的贴敷能力不同。
图4. Janus 薄膜的单向释放功能评价。(a) 将模型蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 加载到 Janus 膜的多孔层中并测量其方向依赖性释放的图示。(b) BSA释放到扩散池两个隔室中的图像； i) Janus Chit/Gelatin膜；ii)通过流延和冷冻干燥制备的多孔Chit/Gelatin对照膜；iii) 通过流延制备的致密Chit/Gelatin对照膜（注：将考马斯亮蓝 G250 添加到两个室中的溶液中以方便观察）。(c) 实时观察 BSA 从薄膜释放到两个室溶液中的情况 (n = 4)，从上图可以看出，BSA可以被Janus Chit/Gelatin膜定向缓释。
图5. Janus Chit/Gelatin薄膜的纤维细胞屏障功能以及分别具有Janus结构和致密结构的Chit/Gelatin薄膜负载骨形态发生蛋白（BMP-2）后的大鼠颅骨缺损模型中引导骨再生的评价。(a) 实验方法，其中细胞冠插入物用交联膜（致密面朝上或多孔面朝上）密封并放置在孔板上以隔离上部和下部体积以评估各向异性细胞引导。(b) 3D 荧光图像显示Janus膜的致密层可以屏障L929成纤维细胞。(c) 术后8周拍摄的治疗后颅骨缺损的显微 CT 成像；(d) 8周修复期后不同组中新形成骨的Van Gieson染色结果与矿化的荧光标记组织结果（红色，4-6 周；绿色，6-8 周）。
本工作展示了电信号调控生物大分子各向异性组装的巨大潜力。施加的电信号可用于对多组分生物大分子进行分类，以创建具有成分和结构梯度的高性能生物材料。论文的第一作者为华东理工“博新计划”获得者雷淼博士后，华东理工硕士研究生廖海涛为论文共同第一作者。论文第一单位为华东理工大学。该研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金，111计划，上海市优秀学术带头人项目，上海市扬帆计划及中国博士后科学基金会等项目的资助。特别鸣谢美国马里兰大学Gregory F. Payne教授以及华东理工大学王诗佳硕士对本研究的杰出贡献。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202307606
