大连理工大学郑楠/湖南大学邱烨 Biomacromolecules：具有α-螺旋结构的硫酸化糖基聚多肽的抗病毒活性研究

2023-06-15 来源：高分子科技

在世界范围内，病毒性疾病对人类健康产生日益严重的威胁，并造成了巨大的社会经济损失，尤其是近年在世界范围内大流行的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起了新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。目前市售的小分子抗病毒药物主要是采用两种抗病毒途径：细胞内干扰病毒复制和细胞外阻止病毒和细胞相互作用。相较于小分子抗病毒试剂，大分子不仅具有结构多样性，还具有可调的聚合度、官能团以及二级结构等优势，这些优势能够对它的抗病毒活性进行有效的调控。细胞表面的硫酸乙酰肝素（HS）已经被证明可以作为多种类型病毒的靶点，例如登革热病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等，而目前流行的SARS-CoV-2的刺突蛋白可以通过其受体结合域，独立地与细胞表面的HS和血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用，形成以HS为支架材料的三元复合物。这启发我们通过引入外源性的HS模拟物去干扰和抑制该作用。与小分子相比，聚合物还具有"多价效应"，通过重复单元或侧链配体可以协同结合多个生物受体。与传统聚合物相比，聚多肽具有良好的生物相容性和独特的二级结构，它的α-螺旋结构能够有助于侧链的完全舒展，进一步增强聚合物的多价效应，有望作为聚合物基抗病毒试剂的骨架结构（图1）。然而，目前将聚多肽材料用于抗病毒方面的研究工作鲜有报道。

图1 抗病毒机制和亮点总结

基于上述理论分析，最近，大连理工大学郑楠课题组和湖南大学邱烨课题组合作开展具有α-螺旋结构的硫酸化糖基聚多肽的抗病毒活性研究。首先合成出一系列具有不同聚合度、构型、刚柔性，侧链基团（羧基、磺酸基、糖基和硫酸化糖基等）的水溶性聚多肽（图2）。以SARS-CoV-2假病毒为模型，系统地研究了聚多肽结构与抗病毒活性之间的关系，筛选出具有较强抗病毒活性的先导化合物L₆₀-SG-POB。此外，进一步研究了硫酸化糖基聚多肽对真病毒，如无包膜肠道病毒（CVB3）的抑制作用，证明了聚多肽抑制病毒增殖的作用机制。

图2 抗病毒聚多肽的结构

作者通过圆二色（CD）光谱对所合成的聚多肽的构型进行表征（图3）。除了采用DL-谷氨酸衍生物作为起始原料的DL₅₈-G-POB和DL₅₈-SG-POB，其余聚多肽均具有螺旋结构。尤其糖基修饰的聚多肽能够达到100%的螺旋度。由于阴离子的引入，硫酸化修饰引起螺旋度的降低，然而疏水作用的提高可以减弱这种效果。相较于具有长刚性侧链的L_{(36, 60,102)}-SG-POB，具有长柔性侧链的L₇₁-SG-AH的螺旋度降低幅度更大（72%）。

图 3. （a-d）聚多肽的CD。（e）L₆₀-SG-POB 在H₂O/MeOH中的CD。（f）L₇₁-SG-AH 在H₂O/MeOH中的CD。括号中数字代表螺旋度。

作者以SARS CoV-2假病毒作为模型，对聚多肽的抗病毒活性进行研究（图4）。首先对侧链结构进行了研究，结果显示，这些聚多肽均能够对病毒产生抑制效果，说明羧基、磺酸基和糖基都能够起到抗病毒作用。其中，抑制率L₆₀-SG-POB > L₆₀-S-POB > L₆₈-C-AP > L₆₈-S-AP，与聚多肽的螺旋度结果一致，说明螺旋结构也发挥了重要作用。由于各种聚多肽重复单元的结构差异，作者也从重复单元的摩尔浓度与硫酸基团的摩尔浓度的角度分析，结果均证明L₆₀-SG-POB的抑制效果最佳，说明糖基和硫酸离子的协同作用提高了聚多肽的抗病毒活性。

随后，作者通过评价不同浓度下的SARS CoV-2假病毒抑制效率，确定L₆₀-SG-POB的最佳剂量，结果显示其半数抑制浓度（IC₅₀）为0.71 μg/mL，并且剂量为3 μg/mL时达到最大抑制效率。当选择更多类型的硫酸化糖多肽时，包括不同的刚柔性、构象和分子量，结果证实中等分子量具有与病毒更良好的亲和力和合适的位点结合力。与无规卷曲构型的DL₅₈-SG-POB相比，具有螺旋结构的L₆₀-SG-POB展现更高的抑制率（85%），远远超过市售的抗病毒试剂（肝素钠），这主要是因为螺旋结构能够增强硫酸糖的侧链的舒展和暴露，从而增强多价效应，提高位点结合力。具有柔性侧链的聚多肽则显示出较低的抑制率，这可能是因为离子的静电作用和疏水作用对抗病毒效果均有影响。以上结果证明了螺旋构型和硫酸化糖基侧链能够增强病毒的抑制作用（图5）。

图4. 聚多肽的抑制率，（a）质量浓度为2 μg/mL；（b）硫酸基团浓度为4.3 μM。

图5. （a）L₆₀-SG-POB的抑制率-剂量曲线。（b）硫酸化糖基聚多肽对新冠假病毒的抑制率。

为了进一步研究这类聚多肽能否抑制真病毒的复制和增殖，作者选用了一种无包膜的肠病毒（CVB3）用于研究非膜的抑制效应（图6）。L₆₀-SG-POB的抑制率-剂量曲线显示其在10 μg/mL的剂量下达到最大抑制效果。无规卷曲构型的DL₅₈-SG-POB依然展现了最低的抑制率。L_{(36, 60,102)}-SG-POB、L₇₁-SG-AH展示了相似的抑制效果，却低于市售的抗病毒试剂（肝素钠）。不同于对具有包膜的假病毒的抑制效果，缺乏包膜的肠病毒经常表现出不容易被聚多肽抑制，因此针对CVB3的IC₅₀值相对较高。然而，在对CVB3的进一步深入研究证明，硫酸化聚多肽具有干扰病毒内化后复制或者增殖的能力。

图6. （a）L₆₀-SG-POB的抑制率-剂量曲线。（b）硫酸化糖基聚多肽对CVB3的抑制率。

综上所述，聚多肽能够抑制SARS-CoV-2的机制可能涉及硫酸化糖基聚多肽直接与病毒的包膜相互作用，从而阻隔病毒与受体的结合和膜融合。该研究为开发新型抗SARS-CoV-2的聚合物抑制剂提供了新的设计思路，并且证明了具有α-螺旋结构的硫酸化糖基聚多肽有望作为新型广谱的抗病毒试剂。

相关成果发表在Biomacromolecules（Sulfated Glycomimetic α-Helical Polypeptides for Antiviral Activity, Articles ASAP, DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00184），论文的第一作者为大连理工大学化工学院博士研究生徐翔；通讯作者为大连理工大学郑楠副教授和湖南大学邱烨副教授。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c00184

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（责任编辑：xu）

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