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任东文，刘袖洞，马小军（中科院大连化学物理研究所生物医学材料工程组，中科院研究生院，辽宁大连116023）A kinetics study of labeling reaction of chitosan with a fluorescent dyeREN Dong-wen, LIU Xiu-dong, MA Xiao-jun(Lab. Of Biomedical Materials Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)
Abstract：Fluorescein Isothiocyanate is a commonly used fluorescent dye to label chitosan, which is an important way to study the in vivo distribution, biodegradation and adsorption of chitosan. This article was mainly focused on this labeling reaction and studied the influence of pH value of chitosan solution, the solvent of FITC and the temperature on the reaction kinetics, and a quick and stable way to prepare fluorescent chitosan was expected. It was found that higher pH value could boost reaction velocity, while too high pH value, such as 7.7 and 8.5, could not bring any difference. with each other. The solvent of FITC could affect the reaction and methanol as solvent gained a higher velocity than PBS. A higher reaction velocity.was obtained on a higher temperature.Key words：chitosan；fluorescent labeling；reaction kinetics摘要：壳聚糖的荧光标记是研究壳聚糖在体内的分布、降解和吸收的重要方法之一。荧光素异硫氰酸酯(FITC)是一种常用的荧光染料。本文考察了FITC与壳聚糖氨基反应时，溶液pH值、FITC溶剂以及温度对反应动力学的影响，以期建立一种快速、稳定的制备荧光标记壳聚糖的方法。结果表明：随着pH值增大，反应加快，但＞7.7时，则对反应无影响；甲醇作为FITC的溶剂时反应速度大于PBS；随着反应温度的升高，反应速度也随之加快。关键词：壳聚糖；荧光标记；反应动力学中图分类号：Q648；R819 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊1 引言 壳聚糖是由天然高分子甲壳素衍生而得到的一种氨基多糖，在生物医用材料领域，如药物控释、组织支架方面，受到广泛的关注和研究[1~4]。当壳聚糖作为生物医学材料应用时，常常需要研究壳聚糖在体内的分布、降解和吸收。但是研究中发现壳聚糖的定位非常困难，这是由于壳聚糖并没有颜色，在紫外也没有明显的吸收。因此常常需要将壳聚糖与一些特定的化合物结合达到标记的效果。常用的标记方法主要有放射标记和荧光探针标记。放射标记需要特殊的设备和训练，操作不方便。而荧光探针标记简单易操作，可使用标准仪器测定，而且还有以下两个优点[5]：（1）荧光探针标记后的壳聚糖在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下清晰可见，因此使得壳聚糖微胶囊、微球或微粒的定位变得容易。（2）荧光的检测敏感性比传统紫外/可见方法高3~4个数量级，因此使得壳聚糖的检测和定量更加准确。 壳聚糖的荧光标记常用荧光素异硫氰酸酯(FITC)，标记后的壳聚糖在一定波长激发光的作用下，发出强烈的绿色荧光，可用于研究壳聚糖的体内代谢和分布[6]、壳聚糖与小肠粘膜的作用[7]以及壳聚糖微粒的吸收[8]。但是现有文献大多集中于荧光标记壳聚糖的应用，缺乏对标记反应本身的研究。本论文研究了反应pH值、FITC溶剂以及反应温度对标记效率的影响，期望得到一种快速、稳定的荧光标记壳聚糖的制备方法。2 材料与方法2.1 材料与仪器 壳聚糖（山东海得贝，经本实验室过氧化氢降解处理，脱乙酰度为93%，分子量为6.2万），乙醇胺（Sigma），荧光素异硫氰酸酯(Sigma)，其余为分析纯，使用前未经进一步处理。恒温振荡培养箱（哈尔滨东联电子），紫外可见分光光度仪（岛津）。2.2 壳聚糖的FITC标记 将壳聚糖溶于醋酸缓冲溶液(0.2 mol/L CH3COOH + 0.1 mol/L CH3COONa)，或0.1 mol/L CH3COOH溶液，用1 mol/L NaOH溶液调整其pH值，然后用去离子水定容，得到1% 壳聚糖溶液。取10ml此溶液于100ml锥形瓶中，具塞后分别置于不同温度恒温振荡培养箱中，以150rpm速度振荡恒温30min后，迅速加入一定量的FITC溶液（溶剂为甲醇或磷酸缓冲溶液PBS，pH7.4），具塞，继续以同样振荡速度在恒温条件下反应。2.3 标记效率的测定 按照实验设计，在不同的时间每次取样0.2 ml，加入0.2 ml 1% (体积分数)乙醇胺水溶液，振荡混匀，以猝灭未反应的FITC，此时壳聚糖为絮状沉淀。以乙醇和去离子水洗涤壳聚糖沉淀，离心后吸取上清液。反复多次至上清液于495nm处无吸收为止。最后加入pH值为6.0的醋酸缓冲溶液5 ml，振荡溶解后，将得到的溶液于495nm处测定其吸收值。标记效率：FITC(µg)/壳聚糖（mg）。3 结果与讨论3.1 壳聚糖溶液pH值对标记效率的影响 该标记反应的原理是，由壳聚糖氨基中氮原子上的孤对电子进攻FITC分子的异硫氰酸酯基团中带正电性的碳原子，如图1所示：
由此可见，壳聚糖分子中的氨基只有在游离状态下才能发生反应，溶液中氨基的浓度决定着反应的快慢。因此pH值是影响反应速率的一个重要因素。如图2所示，当pH值为7.7和8.5时，反应在1h即达到平衡，标记效率可达到为0.6。而pH值为6.5和3.1时，反应平衡时间大大增加为4h，而且标记效率仅为0.2左右。这是由于pH值升高，溶液中游离氨基的浓度增加，因此反应速度加快。壳聚糖分子中氨基的pKa一般为6.5左右，因此当溶液的pH值较高时（如本实验中的7.7和8.5），壳聚糖分子中氨基已全部为游离状态，并不随pH值的增加而浓度增加，因此反应速度不变。
3.2 FITC溶剂对标记效率的影响 FITC的溶剂对反应的速度的影响如图3所示。反应达到平衡的时间均为4h，但是甲醇作为溶剂，平衡时标记效率为0.5，而PBS为溶剂时仅为0.2，由此可以看出甲醇替代PBS作为FITC溶剂可以加快反应速度。
3.3 反应温度对标记效率的影响 由图4可以看出，当反应温度由5℃，升高为25℃和40℃时，反应时间4h，标记效率分别为0.1，0.2和0.4，由此可见反应速度随温度升高而增大。
4 结论 研究结果表明，影响FITC与壳聚糖结合的反应条件主要是壳聚糖溶液pH值、FITC的溶剂和反应温度。（1）pH值对反应的影响明显，随着壳聚糖溶液pH值的升高，反应速度加快，pH值>7.7时，pH值升高对反应速度无影响；（2）以甲醇替代PBS作为FITC的溶剂时，反应速度加快；（3）反应速度随温度升高而加快。参考文献：[1] Canh Le Tien, Monique Lacroix, Pomplilia Ispas-Szabo, Mircea-Alexandru Mareescu, N-acylated chitosan: hydro- phobic macrices for controlled release. [J]. Journal ofControlled Release, 2003, 93: 1-13.[2] Sundararajan V. Madihally, Howard W.T. Matthew, Porous Chitosan scaffolds for tissue engineering. [J]. Biomaterials, 1999, 20: 1133-1142.[3] Sung Eun Kim, Jae Hyung Park, Yong Woo Cho, Hesson Chung, Seo Young Jeong, Eunhee Bae Lee, Ick Chan Kwon, Porous chitosan scaffold containing microspheres loaded with transforming growth factor-β1: Implications for cartilage tissue engineering. [J]. Journal of Controlled Release, 2003, 91: 365-374.[4] J.-K. Francis Suh, Howard W.T. Matthew, Applications of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. [J]. Biomaterials, 2000, 21: 2589-2598.[5] Anette Brunner, Yoshiharn Minamitake, Achim Gopferich, Labelling peptides with fluorescent probes for incorporation into degradable polymers. [J]. European Journal of Pharma- ceutics and Biopharmaceutics, 1998, 45: 265-273.[6] Hiraku Onishi, Yoshiharu Machida, Biodegradation and distribution of water-soluble chitosan in mice. [J]. Bioma- terials, 1999, 20: 175-182.[7] Roula B. Qaqish, Mansoor M. Amiji, Synthesis of a fluore- scent chitosan derivative and its application for the study o f chitosan-mucin interactions. [J]. Carbohydrate Polymers, 1999, 38: 99-107.[8] Min Huang, Zengshuan Ma, Eugene Khor, Lee-Yong Lim, Uptake of FITC-chitosan nanoparticles by A549 cells. [J]. Pharmaceutical Research, 2002, 19: 1488-1494.基金项目：国家高技术研究发展计划（863）计划（2001AA326020）作者简介：任东文（1974－），男，重庆江津人，中科院大连化物所博士研究生。主要研究方向：壳聚糖作为生物医用材料的可控降解。（E-mail: rendw@dicp.ac.cn）, Fax: 0411-84379139, Tel: 0411-84379096论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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