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王彦卿 张朝平（贵州大学化学与生化学院化学系，贵州贵阳550025）Preparation and release study of magnetic drugloaded gelatin microspheresWANG Yan-qing, ZHANG Chao-ping(Department of Chemsitry, College of Chemistry and biochemistry, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
Abstract：The gelatin microspheres loaded with norfloxacin were prepared by means of reverse phase suspension cold-condensation method using Fe3O4 as core, The products were characterized by SEM、TEM、drug loading rate、drug release behavior and microspheres degradation .The results showed that microspheres were spherical in shape with smooth surfaces, the microspheres characterization were effected by the gelatin concentrations、glutaraldehyde concentrations and different crosslinking time periods . The microspheres size was increased with an increase in the gelatin concentrations, Both the released amount and the microspheres degradation were decreased with an increase in the glutaraldehyde concentration and crosslinking time period.Key words：gelatin；norfloxacin；drugloaded microsphere；degradation；controlled release摘要：以诺氟沙星为水溶性模型药物，采用反相悬液冷冻凝聚法制得包裹Fe3O4微粒和药物的磁性明胶微球，考察了磁性载药微球的制备条件对微球的成球率、药物包裹率、体外释药及微球降解情况的影响。结果表明，明胶的浓度、戊二醛的用量、固化时间等均对微球的结构和性能产生影响，经优化条件得到了成球率、药物包裹率、体外释放都较好的载药微球。关键词：明胶；诺氟沙星；载药微球；降解；控制释放中图分类号：R944.15 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊1 引言 近年来，靶向药物控制释放体系是医学领域研究的热点，用高分子材料作为载体的磁性药物微球经注射等手段进入人体后，采用体外强磁场引导定位，使药物微球浓集和停留在靶区，并产生栓塞，然后局部释放药物，可使欲治疗区药物浓度大为提高，而正常组织受药量极低，这样就降低了药物的毒副作用，提高了疗效，而且通过高分子包裹，可延长药物的生理活性，提高药物的稳定性，使药物的释放达到较为理想的效果。高分子磁性载药微球同时具有靶向性和控释性，是当前药物新型制剂最活跃的领域之一[1]。 目前，国外对磁性药物微球的研究进展十分迅速。早在70年代Pilwat及Widder[2]制成一种注射用的盐酸阿霉素磁性蛋白微球；James M.Gallo[3]及Emad Eldin Hassan[4]等人制成磁性葡聚糖、壳聚糖药物微球，而磁性明胶药物微球少见报道。而且关于磁性明胶载药微球的制备条件对微球的成球率、药物包裹率、体外释药及微球降解情况的影响也未见报道。本文选用具有良好生物相容性的明胶作为载体，以诺氟沙星为水溶性模型药物，Fe3O4作为磁性内核，戊二醛作交联固化剂，采用反相悬液冷冻凝聚法，制备出了强磁性的诺氟沙星明胶微球，具体考察了明胶的浓度、戊二醛的用量、固化时间等条件对微球的结构和性能产生的影响。2 实验2.1 试剂与仪器 明胶(上海生物工程有限公司) 、诺氟沙星（中国贵阳制药厂）、戊二醛（中国医药集团上海化学试剂公司，BR）、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NH3·H2O、Span-85、石油醚、乙醚均为分析纯试剂，水为二次蒸馏水。 超声波振荡器（SG2200HE型，上海冠特超声仪器有限责任公司）、离心机（TGL-168型、上海安亭科学仪器厂制造）、透析袋（美国）、真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）、JEM-2000FX-II型高分辨率透射电镜（日本电子公司）、KYKY-1000B扫描电子显微镜(中国科学院科学仪器厂)、Vector 22红外光度计（Bruker公司, 德国）、岛津UV-265紫外可见光谱仪、Nikon MODEL ECLIPSE E-400光镜(Japan)。2.2 实验步骤2.2.1 Fe3O4磁性微粒内核的制备[5] 称取一定量的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O (nFe2+/nFe3+=1:1)，加入一定体积的二次蒸馏水，在一定温度下搅拌,使FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O充分均匀混合、自然静置冷却、滤掉杂质部分，在一定温度、剧烈搅拌下快速加入NH3·H2O，直至Fe3O4完全生成，然后晶化1h。用蒸馏水洗涤，过滤而得。主体反应为： Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4(S)+4H2O2.2.2 诺氟沙星磁性明胶微球制备[6] 取上述制备出的Fe3O4 微粉加入到一定体积和浓度的诺氟沙星(经纯化)明胶溶液中，控温、搅拌，形成A液，作为水相；另于100ml的液体石蜡中加入2ml Span-85,搅拌均匀，配成B液，作为油相；再将A液缓慢匀速滴入B液中，搅拌10min，形成C液，将C液置于4℃的水浴中，滴加一定量的戊二醛（25%w/v），搅拌固化一定时间后，分别用石油醚、乙醚洗涤数次，微球在40℃下真空干燥，无需粉碎即得药物微球(表1)。
2.2.3 药物微球包裹率的测定 精确称取样品微球10mg溶于10ml 0.1mol/L的乙酸水溶液中，超声波振荡5min，高速离心分离，把上层清液过滤后用岛津UV-265紫外/可见光谱仪在波长272nm[7]下测其吸光度，根据药物的标准吸收曲线的线性回归方程计算微球表面吸附药物的含量。把离心后的残留物再次用10ml 0.1mol/L的乙酸水溶液溶解，在4℃下密封保存24h后在波长272nm下测其吸光度，计算微球内所包药物的含量。 计算药物微球包裹率的公式如下： 包裹率=（药物的质量/明胶微球中药物的理论质量）×100%。2.2.4 药物微球的体外释放 采用动态透析法测定。精确称取样品微球50mg置于透析袋内，加入磷酸缓冲液(pH=7.4)5.0ml。透析袋外为相同pH值的磷酸缓冲液250ml，置于37.5℃恒温水浴中，磁力搅拌，每隔30min取10 ml磷酸缓冲液进行药物含量的测定，每次取样后立即补给10ml磷酸缓冲液。2.2.5 降解微球的光镜观察 分别取一定量降解240h后微球的磷酸盐缓冲溶液滴在洁净的载玻片上，用Nikon MODEL ECLIPSE E-400光镜进行观察，并拍下对应照片。3 结果与讨论3.1 Fe3O4粒子的TEM和磁性明胶药物微球的SEM形貌 通过(TEM)图片(图1)可以看出Fe3O4粒子粒径的分布窄，大部分在20nm以下，而且Fe3O4粒子的分散性好，大部分微粒都呈球状。通过图（2）磁性明胶药物微球的SEM形貌可以看出，Fe3O4粒子、药物已经被明胶复合成球体，微球成球性好，成球率高，大小均一，无粘连。当明胶浓度为10%时（图2 A-1）制得的微球粒径多数在10μm以下，而明胶浓度为20%时（图2 A-3）制得的微球粒径多数在15~25μm之间，由此可以看出，随明胶浓度的增大，微球的粒径相应增加。另外，我们用光镜对其它样品进行观察，发现戊二醛的用量、固化时间的长短对微球的粒径影响较小。
3.2 药物微球的包裹率 根据诺氟沙星药物在λ=272nm的标准曲线得线性回归方程A=0.0962571C+0.0195714，R=0.999786，分别计算出各样品微球的表面吸附药物、内包药物、微球包裹率(图2)。影响药物微球包裹率的主要因素有微球的制备方法，药物和载体的浓度，药物的性质，交联固化的方式及微球粒径的大小等。本文通过改变明胶的浓度，戊二醛的用量和固化时间等制备条件对药物微球包裹率作了研究，从(Table II)中看出，随着明胶浓度的增大，包裹率从42.24%增大到63.28%。原因是随着明胶浓度的增大，微球的粒径增大（见图2），包裹层变厚，从而使包裹率增大。改变戊二醛的用量(0.2ml、0.6ml)，包裹率从50%增大到67%，这是由于戊二醛中的醛基（—CHO）与明胶酰胺中的氨基（—NH2）发生交联反应：GLA—CHO+Gelatin－NH2 GLA—C==N—Gelatin 交联反应的结果形成了多个蛋白分子交接的网状结构，随着戊二醛用量的增加，蛋白分子间的“搭桥”频繁，交联网点密度提高。
3.3 药物微球的体外释放 本研究制得的微球具有较好的缓释性。从图3、4中看出各样品微球的体外释放具有共同点，就是微球中的药物在前60min内溶出较多，这是因为药物由进入微球的溶剂溶解后，经明胶包裹层的空隙而扩散到介质中，而微球表面药物的溶解及扩散则形成释药的突释效应，而后随着明胶层的降解，明胶分子缓慢伸展呈纤维状，长时间维持球形作为Fe3O4和药物的骨架，且分子间隙增宽，使药物均匀缓慢的释放。 但是，随着明胶浓度的增大，微球中的药物释放率明显降低，从90.4%降到74.2%，这是因为随明胶浓度的增大，微球的粒径相应增加，包裹层增厚；同时，明胶浓度的增大还使蛋白质大分子间的接触点增加，可形成更多的螺旋结构，分子的相对运动所受到的作用力也就越大，因此，微球中明胶包裹层的降解就越缓慢，药物释放率就相应降低。 随着戊二醛的用量和固化时间的增加，明胶蛋白分子与戊二醛交联的网点密度提高，从而使分子间链的作用力进一步加强，宏观上表现为微球表面的明胶膜强度上升[8]，导致明胶的溶胀与溶出率明显减小，所以微球中药物的释放率也随之降低，从81.58%降到71.96%。这就可以通过选择不同明胶浓度、戊二醛的用量、固化时间等条件来控制药物的释放率。
3.4 微球降解光镜观察 图5为各药物微球降解240h后的光镜照片，发现微球均有不同程度的降解。
明胶浓度为10%时制得的微球几乎完全崩解，明胶分子已经完全伸展呈纤维状。但随明胶浓度的增大，微球的粒径增大，包裹层变厚，微球保持完整，只是明胶包裹层的溶胀和溶出率明显减弱，降解越慢。随着戊二醛的用量、固化时间的增加，微球表面的明胶膜的拉伸强度上升[8]，明胶包裹层的溶胀和溶出率也减弱，只是不如改变明胶浓度时制得的微球的降解现象明显。通过微球降解的光镜观察，更进一步证实不同明胶浓度、戊二醛的用量、固化时间等不同条件下制成的载药微球的药物释放规律。4 结论 （1）使用反相悬液冷冻凝聚法制备的诺氟沙星磁性明胶微球，其制备方法简便，粒径小，成球性好，能够很好地把药物和Fe3O4包埋在明胶蛋白之中。药物微球具有较好的缓释性，结构较稳定，可用于靶向给药和磁性控制给药。 （2）随着明胶浓度的增大，制得微球的粒径增大，药物的包裹率增大，释放率降低；随着戊二醛的用量、固化时间的增加，微球的粒径变化不大，药物的包裹率增大，释放率降低，降解减弱。所以，通过优化制备条件，可以做到对微球的粒径和形貌以及药物的包裹率、释放率等加以控制。参考文献：[1] Gupta P K, Hung C T. Magnetically controlled targeted micro-carrier systems. [J]. Life Sci, 1989,44:175.[2] Widder K J, Senyei A E, Scarpelli DG. Magnetic microspheres. A model system for the specific drug delivery in vivo. [M]. Proc Soc EXP med, 1978, 58:141.[3] Emad Eldin Hassan, Royc C. Parish. Optimized Formulation of Magnetic Chitosan Microspheres Containing the Anticancer Agent, Oxantrazole. [J]. Pharmaceutical Research, 1992, 19(3): 390-397.[4] James M, Gallo. Emad Eldin Hassan. Receptor-Mediated Magnetic Carriers: [J]. Basis for Targeting Pharmaceutical Research, 1988, 5(5): 300-304.[5] 丁明, 曾恒兴. 中和沉淀法Fe3O4的生成研究. [J].无机材料学报, 1998, 13(4): 619-623.[6] Ida Genta, Monica Costantini, Annalia Asti, et al. Influence of glutaraldehyde on drug release and mucoadhesive properties of chitosan microspheres Carbohydrate Polymers, 1998, 36: 81-88.[7] 韦平原, 曾毅, 等. 诺氟沙星葡萄糖注射液中诺氟沙星的含量测定. [J]. 中国药事, 2003, 17(4): 238-239.基金项目：贵阳市科技开发基金（2001(01)）；贵州省教育厅科技开发基金（2001(101)）作者简介：王彦卿(1976－)，男，贵州大学化学与生化学院化学系硕士研究生。研究方向：纳米材料和纳米药物。E-mail: meired79@sohu.com论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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