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胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖（CKCS）共混膜的生物相容性研究 |
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| 胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖（CKCS）共混膜的生物相容性研究 |
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JPG图片格式
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胶原 蛋白 葡甘 聚糖 聚糖 CKCS 混膜
生物 相容性 研究 |
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高分子化学 |
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来源网络 |
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王碧1,3，王坤余2，张廷有2，但卫华2,3（1. 内江师范学院化学系，四川内江641112；2. 皮革化学与工程教育部重点实验室（四川大学）， 四川成都610065；3. 四川大学组织工程皮肤研究室，四川成都610065）Biocompatibility of collagen-Konjac glucomannan-chitosan blend filmWANG Bi1,3, WANG Kun-yu2, ZHANG Ting-you2，DAN Wei-hua2,3（1. Department of Chemistry, Neijiang Teachers College, Neijing 641112，China;2. Key Lab. of Leather Chemistry and Eng. (Sichuan University)，Ministry of Education，Chengdu 610065,China;3. Derma Tissue Engineering Laboratory，Sichuan University，Chengdu 610065, China)
Abstract：The cell compatibility and blood compatibility of collagen-Konjac glucomannan- chitosan (CKCS) blend film were studied by the cultivation of endothelial cell-CKCS film, histology evaluation, MTT assay, hemolysis degree and recalcification time. The results provided the theoretical foundation for the application of the blend film.Key words：collagen-Konjac glucomannan-chitosan blend film；cell compatibility；blood compatibility；biocompatibility摘要：通过内皮细胞-膜复合物的培养、组织学观察和MTT法对细胞增殖的测定以及动态凝血实验、溶血实验和复钙实验考察了胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖（CKCS）共混膜的细胞相容性和血液相容性，为共混膜在生物医学领域的应用提供理论依据。关键词：胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖（CKCS）共混膜；细胞相容性；血液相容性中图分类号：R318.08 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊-2457-041 引言 生物相容性是指生命体组织对材料产生反应的一种性能，即材料与宿主之间的相互容纳性，包括组织相容性和血液相容性。成功的生物材料与宿主之间应有良好的相容性，至少要使发生的反应被宿主接受，不产生有害作用。因此，研制生物材料必须对材料进行生物安全性评价，即生物学评价。已见报道的生物学体外评价方法中研究最活跃的是细胞相容性和血液相容性[1~3]。 文献[4]利用溶液共混法将葡甘聚糖和壳聚糖同时与胶原蛋白共混制备了CKCS膜，并通过FTIR、XRD、SEM及透光率测试等方法表征了共混膜的结构，研究了胶原蛋白、葡甘聚糖和壳聚糖3种高分子的相互作用及相容性，并考察了共混膜的力学性能、溶胀吸水率，测定了共混膜的透水汽性、对牛血清蛋白的吸附性以及生命代谢的小分子物质NaCl、色氨酸和葡萄糖等的渗透性。本文选用血管内皮细胞（VEC），通过细胞组织学观察和MTT法对细胞增殖的测定以及动态凝血实验、溶血实验和复钙实验研究CKCS膜的细胞相容性和血液相容性，以进一步评价其生物相容性。2 实验2.1 材料和方法2.1.1 材料与试剂 胶原蛋白、葡甘聚糖和壳聚糖的分离纯化及CKCS膜的制备和处理按文献[4]的方法进行。固定共混膜中葡甘聚糖和壳聚糖的质量比为X1，根据共混膜中胶原蛋白分别为70%，50%，25%，将真空干燥共混膜分别标记为CKCS-1、CKCS-2、CKCS-3；葡甘聚糖和壳聚糖的质量比为X2，胶原蛋白含量为50%时，共混膜标记为CKCS-4；葡甘聚糖和壳聚糖的质量比为X3，胶原蛋白含量为40%时，标记为CKCS-5；X1、X2和X3的关系为X2＞X3＞X1；葡甘聚糖与壳聚糖质量百分比为33/33时，标记为CKCS-6。 无水乙醇及75%乙醇，PBS溶液，DMEM/F12培养基，DMF培养液，10%小牛血清蛋白，1%双抗液，10%甲醛溶液，HE染色剂，MTT溶液（5mg/mL），三联液（10%SDS-5%异丙醇-0.01 mol/L HCl）。 新鲜兔血（华西动物实验中心提供）。枸橼酸钠、NaCl、CaCl2等均为分析纯。2.1.2 实验方法2.1.2.1 细胞相容性研究 （1）细胞-膜复合培养 材料的处理：按培养板孔径大小分别将CKCS-5剪成小圆片，放置于孔板底部，用75%乙醇浸泡消毒后，用PBS液反复冲洗，然后用DMEM/F12 培养基浸泡24h，待用。 细胞-膜复合培养：将人体血管内皮细胞按文献[5~6]的方法消化分离，种植于底部平铺有膜（CKCS-5）的96孔板中，种植密度为3×103个/孔，加入DMF完全培养液（含10%小牛血清、1%双抗），每孔种植200μL，将培养板置于37℃，5%CO2培养箱中恒温培养。对照组为聚苯乙烯培养板，即直接接种细胞到孔板中，空白组以200μL完全培养基代替细胞悬液接种细胞，每个样品平行种植5组。 （2）细胞-膜复合物的组织学观察 取培养一周的VEC-膜复合物，用10%甲醛固定，无水乙醇梯度脱水，经透明、浸蜡和包埋后切片，切片厚度为5μm。HE染色，树脂封片。光镜下观察，照相。 （3）细胞增殖检测 细胞接种后第一、第二、第四和第八天分别用MTT法测定细胞在材料上的增殖，其方法是换无血清培养液100μL，加适量MTT溶液，置于37℃恒温培养箱中4h后，加三联液100μL，再置于37℃恒温培养箱中过夜后，用Model 550酶标仪上测其吸光度（检测波长570nm）。2.1.2.2 血液相容性研究 （1）动态凝血实验 按文献[6,7]的方法进行，采用分光光度法，蒸馏水作参比对照，样品的抗凝血性能由下式用相对吸光度表示：BCI =（I0 / Iw）×100 式中I0为血液和CaCl2的混合液与样品接触一定时间后，血液在540nm处的吸光度；Iw为血液与一定量的蒸馏水混合后的吸光度。平行测定6次，取平均值。 （2）溶血实验 按文献[8]的方法测定CKCS膜的溶血时间。阳性对照用10.00mL蒸馏水加稀释血0.20mL，阴性对照用10.00mL0.9%氯化钠溶液加稀释血0.20mL，以1000r/min离心5min，分别将上清液移入比色皿中，在545nm处测定吸光度。溶血率按下式计算：（Dt-Dnc）/（Dpc-Dnc）×100%式中Dt为样品吸光度，Dnc为阴性对照吸光度，Dpc为阳性对照吸光度。平行测定6次，取平均值。评判标准：溶血率＞5%时，可判断该材料具有溶血作用。 （3）复钙实验 复钙时间测定，其原理是在去Ca2+血浆中，重新加入适量的钙，内源凝血过程得以重新恢复所需的时间。按文献[9,10]的方法测定CKCS膜的复钙时间。平行测定6次，取平均值。3 结果与讨论3.1 细胞相容性3.1.1 组织学观察 培养1周的VEC-共混膜复合物的切片照片如图1所示。由图1清晰可见内皮细胞在共混膜CKCS-5上的粘附、生长情况，表面成片的兰色覆盖层表明细胞已连接成片。 图2表明，内皮细胞在几种材料上的生长有以下特点，第一，生长非常迅速，细胞在基底材料上接种后第一天，在CKCS-5上的细胞活力与对照组聚苯乙烯培养板上表现出了显著差异， CKCS-5上的细胞活力是其对照组的3倍，到第二天时，差异更为显著， CKCS-5上的细胞活力分别是其对照组的4.3倍；显然，接种的前两天，对照组的细胞还处于潜伏期，而在材料CKCS-5上的细胞已进入对数生长期，这表明材料CKCS-5显著促进了内皮细胞的生长。第二，两天后，直到第四天，对照组细胞增殖速度很快，而实验材料CKCS-5的增殖速度明显减慢，生长曲线的坡度相应减小了。这可能是由于细胞在材料CKCS-5上增殖迅速，当细胞在材料上培养到第二天时，细胞已大部分连接成片，几乎铺满了材料整个表面，细胞因此可能开始堆积生长，失去了与基底材料的相互作用，细胞生长速度也就随之减慢了。第三，在第四至八天，细胞在材料CKCS-5上的生长速度的变化与对照组一致，均显著下降。这是由于细胞生长至第四天时，材料CKCS-5表面和对照组聚苯乙烯培养板上均已完全被细胞占据，几乎无细胞再增殖的空间，故表现出明显的接触抑制现象。表1数据表明，细胞在共混膜上的生长与对照组聚苯乙烯培养板上存在显著差异。3.1.2 细胞增殖情况 细胞组织学观察和细胞增殖实验一致表明：胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖共混膜具有良好的内皮细胞相容性。3.2 血液相容性 血液相容性试验可以作为急性毒性反应的体外粗筛试验，在生物安全性评价中起重要作用。3.2.1 动态凝血实验 体外动态凝血时间试验可检测内源性凝血因子被激活的程度，以观察材料对凝血时间的影响。当固定葡甘聚糖与壳聚糖的质量比时，胶原蛋白含量与抗凝血性能的关系如图3所示，由图可知胶原蛋白含量为25%、70%时相对吸光度（BCI）较低，说明这两种膜的抗凝血性差，然而胶原蛋白含量为40%～50%时，BCI值明显增加，胶原含量为50%的CKCS-2抗凝血性能较CKCS-1和CKCS-3好。
实验还测定了葡甘聚糖与壳聚糖质量比与CKCS-2不同，胶原含量为40%的CKCS-5膜的BCI为58，胶原蛋白-壳聚糖二元膜C-CS（质量比1/1）的BCI为29.6，显然，加入葡甘聚糖的三元膜，除胶原含量为70%的CKCS-1外，其余几种CKCS-2、CKCS-5和CKCS-3的抗凝血性能均比二元膜C-CS好。 因CKCS-2、CKCS-5膜在5min内的抗凝血性能较其它三元膜和二元膜好，故进一步测定了它们的抗凝血性能随时间的变化，并与二元膜C-CS比较（见图4），图4表明，所实验3种膜的BCI值均随时间的延长而下降，三元膜CKCS-5和CKCS-2在20min内下降较快，20min后下降较缓慢，而二元膜C-CS膜在10min内下降较快，10min后下降较缓慢，这是因为柠檬酸葡萄糖（ACD）全血中稀释液的BCI值不断下降。
若动态凝血时间曲线缓缓向下倾斜，且经历时间长，表示内源性凝血因子被激活的程度低，材料的抗凝血性能优良；相反，若急陡向下倾斜，表示内源性凝血因子被激活的程度高，材料的抗凝血性能差[7]。因此，可从BCI值变化的快慢程度来评价抗凝血性能的优劣。很显然，三元膜CKCS-5和CKCS-2比二元膜C-CS的抗凝血性能更好，这与5min内的BCI值测定结果一致。3.2.2 溶血实验 生物材料和血液接触后的主要问题是血栓形成和是否引起溶血。溶血实验是采用生物材料或其浸提液做体外实验，测定红细胞溶解和血红蛋白游离的程度，对材料的体外溶血性进行评价的实验方法。由表2可知，胶原蛋白二元和三元共混膜的溶血率均低于5%，仅有微量的溶血，即对红细胞的破坏作用较小，符合生物材料溶血实验要求，在红细胞方面表现良好的血液相容性。
3.2.3 复钙实验 材料与血液接触导致凝血及血栓形成，其主要途径是血液的凝固系统和细胞系统发生激活。表2表明：加入葡甘聚糖的三元膜CKCS-5和CKCS-2的复钙时间较二元膜C-CS延长了，而CKCS-1、CKCS-3、CKCS-6的复钙时间却缩短了，显然，CKCS-5和CKCS-2膜较二元膜C-CS和其余几种三元膜对血液的促凝程度较小，这与动态凝血时间实验结果相符。 上述3项实验表明：与二元膜C-CS比较，加入葡甘聚糖的三元膜对红细胞没有明显的破坏作用，具有良好的血液相容性。动态凝血时间实验和复钙实验均表明，三元膜CKCS-5和CKCS-2对血液的促凝程度较小。CKCS-5和CKCS-2膜良好的血液相容性与文献[4]光电子能谱和表面能测试结果一致。 综上所述，胶原蛋白-葡甘聚糖-壳聚糖共混膜具有良好的细胞相容性和血液相容性，作为潜在的细胞支架材料，在组织工程领域将具有良好的应用前景。致谢：诚挚感谢重庆大学生物工程学院王远亮教授和唐丽灵博士对本文给予的帮助。参考文献：[1] 郭海霞, 梁成浩. 生物材料血液相容性研究进展[J]. 上海生物医学工程, 2001, 21(3):44-48.[2] 杨小芳, 奚廷裴. 生物材料生物相容性评价研究进展[J]. 生物医学工程学杂志，2001，18(1):123-128.[3] 陆炜炜.生物材料血液相容性研究进展[J].国外医学生物医学工程分册，2002，25(5):230-234.[4] 王碧. 制革废弃物提取的胶原特性及与多糖共混生物膜材料的研究[D]. 博士学位论文（成都：四川大学），2003.9.[5] 管建军，高长有，沈家骢.细胞相容性聚氨酯的合成及其细胞相容性研究[J]. 高等学校化学学报，2001，22(2): 317-320.[6] 李立华，屠美，莫文军，等. 聚硅氧烷/液晶复合膜的制备及其血液相容性研究[J]. 功能高分子学报，2000，13(2): 133-136.[7] 王德永，刘日方，李洁华等.介入用聚氨酯材料的血液相容性研究[J].生物医学工程学杂志，2002，19(1):17-19.[8] 刘向阳，张世明，李斌等. 丝素膜血液相容性研究[J].中国血液流变学杂志，2002，12(4): 266-269.[9] 李家增. 血液实验学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1987, 345.[10] 泠永祥，黄楠.氧化钽薄膜的制备及其血液相溶研究[J].功能材料，1998，29(2):639-641.[11] Golden M A，Hanson S R, Kirkman T R, et al.Healing of polytetrafluoroethlene artcrial grafts is influenced by graft porosity [J]. J Vasc Surg. 1990, 11(6): 383-385.基金项目：国家高技术发展计划（863计划）资助项目（2001AA320609）作者简介：王碧（1964－），女，博士，副教授，研究方向：生物材料，E-mail：biwang6312@126.com，电话：13666185985论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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2005-03-15 10:37:37 |
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