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赵燕军，包德才，任东文，郑建华，刘袖洞，马小军(中国科学院大连化学物理研究所, 生物医学材料工程组；中国科学院研究生院， 辽宁大连116023)Preparation of monodispersed chitosan microspheres using nuclepore membrane emulsification methodZHAO Yan-jun, BAO De-cai, REN Dong-wen, ZHENG Jian-hua, LIU Xiu-dong, MA Xiao-jun(Lab. of Biomedical Materials Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)
Abstract：Microspheres have developed rapidly in recent years. However, most materials for microsphere preparation are synthetic polymers.Chitosan, a natural cation polysaccharide, gained worldwide attention and was widely used in many fields such as drug delivery system(DDS) due to its biocompatibility and biodegradability. However, the agitation emulsification and ultrasonic emulsification are still the main methods to prepare chitosan microspheres, but the CV result is still not desirable. To get desired microspheres, numerous researchers tried various ways and themembrane emulsification is one of them. Compared with other emulsification methods, membrane emulsification technique is simple and low energy-consuming,. Moreover, the emulsion droplets obtained are uniform. In this paper, a new emulsification technique - Nuclepore membrane emulsification was established based on our previous work. The effect of several factors including the membrane pore size, the volume ratio of dispersed phase and continuous phase, the influence of surfactant and temperature on the preparation of microsperes was investigated. The primary experiments show that the membrane pore size play a crucial role in the droplet size and the droplet size increases with the volume ration of two phases. Although the temperature does not influence the droplet size, it decreases the gelation time dramatically. However, the effect of surfactant is obvious to the formation of steady emulsion. In conclusion, the Nuclepore membrane emulsification is an ideal choice to prepare the W/O emulsion and monodispersed micropheres.Key words：nuclepore membrane；membrane emulsification；chitosan；microspheres摘要：选择壳聚糖溶液为分散相，液体石蜡为连续相，首次采用核孔膜乳化方法制备壳聚糖微球。乳滴经戊二醛交联固化后所得微球球形度和单分散性良好（分散系数＜20 %）。主要研究了核孔膜孔径大小、油水相体积比、表面活性剂种类及用量、温度和固化时间对微球制备的影响。结果表明，膜乳化法是制备单分散微球的良好方法。关键词：核孔膜；膜乳化；壳聚糖；微球中图分类号：Q648/R819 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊-2492-041 引言 微球是近年来发展起来的新型药物控释系统[1]，但目前微球制备所用的载体材料中，合成、半合成高分子价格较贵，且来源有限，制备困难。由于壳聚糖(chitosan)是一种阳离子天然多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，因而成为极具潜力的生物材料,制备的壳聚糖微球已被广泛应用于药物控释载体、离子吸附材料研究方面。目前，国内外常用制备方法有搅拌乳化、超声乳化、离子交联等[2]，但所得微球单分散性差。 膜乳化方法是近年来出现的一种新的乳化方法，在食品，药品，化妆品等领域中得到了广泛的关注[3]。该法与传统乳化方法(搅拌，超声等)相比，方法简单、耗能低，最终所制得的乳状液粒径单分散性好。 本实验室在已有工作的基础上，采用了一种全新的膜乳化方法——核孔膜乳化法。其所用的核孔膜又称径迹蚀刻膜(国外商品名称Nuclepore)，是20世纪60代后期在研究固体径迹探测器的基础上发展起来的一种新型微孔膜。目前的膜材料主要是疏水性的聚碳酸酯(PC)和聚酯(PET)，其具有孔分布均匀、机械强度高、化学稳定性好、价格低廉等优点。2 材料和方法2.1 材料和仪器 壳聚糖（购自浙江玉环海洋生物化学有限公司，本实验室加工），无水乙醇、石油醚为分析纯，液体石蜡（沸点60～90℃）、25 %戊二醛、Span 80、Tween80均为化学纯。膜乳化装置（自建）；核孔膜（清华大学核能研究院）；恒温水浴（上海市实验仪器厂）；激光粒度仪LS-100Q(美国贝克曼－库尔特公司)；生物倒置显微镜XDS-1(重庆光学仪器厂)；CK40相差显微镜（日本Olympus公司）；电子天平JA5003（上海天平仪器厂）；FD-1冷冻干燥机（北京博医康技术公司）。2.2 核孔膜乳化原理 和目前研究较多的SPG(Shirasu porous glass)膜乳化和其它管状膜乳化装置不同，核孔膜乳化装置采用的膜为平板膜，有效直径为2.0 cm,表面积为3.1 cm2。其原理是在一定压力下将分散相通过一定孔径的核孔膜分散到连续相中，从而形成均匀分布的W/O(油包水)乳状液，再经交联剂交联，溶剂洗涤后即可得到壳聚糖微球。2.3 壳聚糖微球的制备 室温下，取一定量的分散相壳聚糖溶液（3 ％（w/v））在一定泵速下经核膜乳化装置分散到连续相液体石蜡中(含4％(w/v)Span80)，形成W/O(油包水)乳液，然后缓慢加入一定量的交联剂戊二醛，室温下交联24h，室温下离心，3次，冷冻干燥得单分散的壳聚糖微球。2.4 微球形态观察和粒径测定 取一定量冷冻干燥后的壳聚糖微球分散于1％(w/v)Tween80的水溶液中，在显微镜下观察其形态，在粒度仪中测定其大小和分布。3 结果与讨论3.1 表面活性剂的选择和用量 制备均匀分散且稳定的W/O乳液要求选择HLB值在3～6的表面活性剂，Span80的HLB值为4.3，因此选择其为乳化剂有利于乳液的稳定。在乳化过程中，乳化剂分子吸附在膜表面及乳液液滴表面而起作用，核孔膜的性质决定了表面活性剂在膜表面的吸附行为。3.2 乳滴大小的控制 以往的研究表明，无论是SPG膜乳化[4]还是PTFE膜乳化[5]，乳滴平均粒径的大小均主要由膜孔径大小决定，乳滴大小与膜孔径大小大致呈线性关系。与PTFE膜梯状膜孔相比，核孔膜膜孔是圆柱状的直通孔，且孔径大小均一，因此不必像PTFE膜乳化那样对膜孔大小进行必要的修饰。平均粒径与核孔膜孔径呈线性关系，随着膜孔径的增大，平均粒径增大，膜孔径是控制粒径大小的一个重要因素（图1）。分散系数（CV）随着膜孔径的增大线性减少，主要是由于当膜孔径增大时，粒径增大，液滴间相互粘附的现象减少所致（图2）。
3.3 温度、固化时间及油水相比对微球粒径的影响 一定的交联时间对乳滴固化成微球是必须的，主要是由于交联剂分子的扩散和其与壳聚糖的交联需要足够的时间，而温度升高时能显著缩短这一时间[6]，可能是由于温度升高时，扩散及交联速度均加快的缘故。油水相体积比越小，平均粒径越大，可能是由于分散相液滴间碰撞几率较大所引起的，当油水相体积比增大时，平均粒径显著减小（图3）。
3.4 微球形态观察和粒径测定 W/O乳状液经交联固化成球后，洗涤，冷冻干燥，然后分散于Tween80溶液中，用粒度仪测粒径大小及分布（图4），在显微镜下观察形态(图5)，其主要参数为，壳聚糖粘均分子量20万，脱乙酰度90 %，分散相浓度3 %，膜孔径10.0 µm，油水相体积比为15。由两图可见微球粒径主要分布于15～40 µm间，单分散性较好。
4 结论 主要讨论了用核孔膜乳化方法制备单分散壳聚糖微球。由于核孔膜的疏水性和其膜孔为圆柱状直通孔，决定了其在制备W/O型乳液方面比疏水处理的SPG膜有很大的优势。所得乳滴平均粒径大小主要由核孔膜孔径决定，孔径越大，平均粒径越大；油水相体积比越大，平均粒径越小；升高温度能显著缩短交联时间；表面活性剂对微球制备的影响较为复杂，但一定量的表面活性剂对稳定乳液，制备单分散微球是必需的。综上所述，核孔膜乳化法作为一种新型的膜乳化方法是制备稳定的W/O型乳液及单分散壳聚糖微球的较佳方法。参考文献：[1] Neelesh K Varde, Daniel W Pack. Microspheres for contro- lled release drug delivery. [J]. Expert Opin Biol Ther, 2004, 4 (1): 53-64.[2] Dini E, Alexandridou S, Kiparissiders C, et al. Synthesis and characterization of cross-linked chitosan microspheres for drug delivery applications. [J]. J. Microencapsulation, 2003, 20(3): 375-385.[3] Simon M. Joscelyne and Gun Trägårdh. Membrane emulsi- fication-a literature review. [J]. J. Membr.Sci, 2000, 169(1): 107-117.[4] 包德才, 张琼钢, 马小军. 含VE微胶囊的制备及其控制释放性能研究. [J]. 物理化学学报, 2004, 20(2): 178-181.[5] Naohiro Y, Hajime Y, Masatoshi N. Preparation of W/O (Water-in-Oil) Emulsions Using a PTFE (Polytetra- fluoroethylene) Membrane-A New Emulsification Device. [J]. J Disper Sci Technol. 2003, 24(2): 249-257.[6] George A, Roberts F, Kathryn E. Taylar. The formation of gels by reaction of chitosan with glutaraldehyde. [J]. Makromol. Chem. 1989, 190: 951-960.基金项目：国家自然科学基金资助项目(20176056；50373046)。作者简介：赵燕军（1980—），男，山西临汾人，硕士在读，中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组，主要方向为单分散的小粒径微胶囊及作为药物载体的研究。（E-mail: zhaoyj@dicp.ac.cn），Fax: 0411-84379139, Tel: 0411-84379096.论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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