由于实体瘤组织的高渗透长滞留（Enhanced permeability and retention effect，EPR）效应，纳米颗粒/药物常具有明显的肿瘤蓄积能力，因此纳米颗粒/药物成为了诊断、治疗甚至根除肿瘤的常用手段。开发具有增强的被动肿瘤靶向作用的纳米平台对癌症纳米医学应用至关重要。各种纳米平台如脂质体、树状大分子、纳米凝胶、胶束等已广泛应用于基于EPR效应的癌症成像和治疗。

  在众多纳米平台体系中，树状大分子是一类高度支化的、三维立体结构的单分散大分子，具有从核心以迭代方式向外延伸的树枝状楔形物。树状大分子独特的物理、化学和生物学特性为人类健康纳米医学的发展提供了重要手段。其中，聚酰胺-胺（Poly(amidoamine), PAMAM）树状大分子具有与蛋白质相似的结构，并且由于其具有良好水溶性、非免疫原性和易官能化等特点，已被广泛应用于生物医学研究领域。

  一般而言，低代树状大分子更容易合成，但具有相对更高分子量和纳米尺寸的高代树状大分子（G4或更高）却显示出更好的基因转染效率、载药量以及渗透能力。然而，树状大分子代数越高，合成步骤就越繁琐，纯化也相对困难，其价格也相对比较昂贵，从而限制了其有效的肿瘤治疗和成像应用。为了克服单代树状大分子的局限性，研究者开发了以高代树状大分子为核、低代树状大分子为壳的核壳结构树状大分子（core-shell tecto dendrimers, CSTDs），不仅保持了与高代树状大分子相似的特性，而且合成简单，操作方便。

  在前期的研究中，史向阳教授团队利用环糊精（CD）与金刚烷（Ad）的超分子主客体识别作用，以第五代（G5）PAMAM树状大分子为核、第三代（G3）PAMAM树状大分子为壳构建的G5-CD/Ad-G3 CSTDs可用于增强的基因传递（J. Mater. Chem. B 2017, 5, 8459），也可作为载体实现基因和药物的共递送达到癌细胞的增强的联合治疗（J. Mater. Chem. B 2020, 8, 2768）。另外，史向阳教授团队还基于CD与苯并咪唑（BM）的主客体自组装作用，将BM修饰的乙酰化G3作为壳组分组装到CD修饰的乙酰化G5表面，并将形成的G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc CSTDs作为载体负载抗癌药物阿霉素（DOX），利用CD/BM的酸敏感特性，将CSTDs/DOX纳米平台用于增强的体外肿瘤细胞球的渗透和化疗（Nanoscale 2019, 11, 22343）。研究团队近期还综述了CSTDs和树状大分子超结构的合成方法及其生物医学应用（Bioconjugate Chem. 2021, 32, 225；Coord. Chem. Rev. 2020, 421, 213463）。然而，不足的是，CSTDs目前仅仅局限于体外细胞生物学应用。

  一直以来，MR成像技术因无创性、高灵敏度、高空间分辨率以及优异的3D成像能力而受到研究者的关注。基于此，史向阳教授团队尝试构建了基于CSTDs的MR造影剂，并与具有相同成分的G5树状大分子造影剂相比较，探索其基于EPR效应的肿瘤MR成像的优越性。在本研究中，团队首先通过CD和Ad的超分子识别制备了G5.NH₂-CD/Ad-G3.NH₂ CSTDs，并共价修饰DOTA配体用于螯合Gd(III)，最后对CSTDs表面剩余氨基乙酰化，获得G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc-DOTA(Gd)（CSTD.NHAc-DOTA(Gd)）（图1a）。同时，为方便后续比较，研究团队还合成了单代树状大分子钆螯合物G5.NHAc-DOTA(Gd)。研究结果表明，合成的两种材料具有均匀的球形形态、均一的纳米尺寸，较好的稳定性和细胞相容性。CSTD.NHAc-DOTA(Gd)粒径约为9 nm，而G5.NHAc-DOTA(Gd) 约为6.2 nm（图1）。

图1. （a）CSTD.NHAc-DOTA(Gd)的合成示意图;（b，c）CSTD.NHAc-DOTA(Gd)和（d，e）G5.NHAc-DOTA(Gd)的AFM图和相应高度图。

  随后，研究团队以鼠源乳腺癌细胞（4T1）为模型，构建了3D细胞球用于模拟动物体内实体瘤微环境以探索和比较FITC标记的CSTD.NHAc-DOTA(Gd)或G5.NHAc-DOTA(Gd)的渗透能力。如图2所示，两种材料均对细胞球有一定的渗透性，但在相同FITC浓度下，FITC-CSTD.NHAc-DOTA(Gd)组在细胞球内部的荧光强度显著高于G5.NHAc-DOTA(Gd)组，这表明CSTD.NHAc-DOTA(Gd)的渗透能力远远优于G5.NHAc-DOTA(Gd)。

  研究团队还比较了两种材料的弛豫性能和在体外MR成像中的应用，结果表明，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)及对照材料G5.NHAc-DOTA(Gd)的MR信号强度均和Gd含量呈正相关，在相同Gd浓度条件下，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)显示出比对照材料更强的MR信号强度，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)的r₁弛豫率为7.34 mM^-1s^-1，是对照材料G5.NHAc-DOTA(Gd)（4.92 mM^-1s^-1）的1.5倍，也是临床Magnevist（4.56 mM^-1s^-1）的1.6倍。此外，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)与对照材料G5.NHAc-DOTA(Gd)相比，能够大大提升体外癌细胞的MR成像效果。

图2. 用FITC-CSTD.NHAc-DOTA(Gd)或FITC-G5.NHAc-DOTA(Gd)孵育4T1 3D细胞球6小时（a, b, c）和12小时（d, e, f）后的细胞球荧光成像图和荧光强度分布统计图。其中，比例尺为50 μm，a、d代表FITC-CSTD.NHAc-DOTA(Gd)组，b、e代表FITC-G5.NHAc-DOTA(Gd)组。

图3. 静脉注射CSTD.NHAc-DOTA(Gd)（a）或G5.NHAc-DOTA(Gd)（b）前后不同时间点的体内MR成像图和SNR统计图（c）。白色箭头指向肿瘤部位；注射的材料均溶解在PBS中，[Gd] = 5 mM，用量100 μL/每只。

  进一步地，研究团队建立了4T1皮下瘤模型并通过静脉注射（图3）和瘤周注射（图4）两种方式对注射材料前后的荷瘤小鼠进行了MR成像。静脉注射后，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)及G5.NHAc-DOTA(Gd)组的小鼠肿瘤部位MR信号强度都出现了先增大后减小的现象，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)组的MR信号强度2.5小时达到了最高值，而G5.NHAc-DOTA(Gd)组在1小时就达到了最高值，说明拥有更高分子量的CSTD.NHAc-DOTA(Gd)具有较长的血液循环时间，从而放大了EPR效应，并延长了材料在肿瘤部位的积聚。与注射前的SNR值相比，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)在肿瘤部位的MR SNR值在注射2.5小时后增加了72.4%，远高于对照组G5.NHAc-DOTA(Gd)的SNR增加情况（增加了57.2%）。瘤周注射两种纳米材料后，肿瘤的MR SNR均在注射后3 h达到峰值，然后随着时间的延长而逐渐降低，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)组肿瘤部位的MR信号强度和SNR值在同一时间点都高于对照组G5.NHAc-DOTA(Gd)，这也是归因于CSTD.NHAc-DOTA(Gd)比G5.NHAc-DOTA(Gd)具有更好的渗透性和更高的r1弛豫率。总之， CSTD.NHAc-DOTA(Gd)表现出放大的肿瘤EPR效应，达到增强肿瘤MR成像的效果。此外，组织分布以及器官切片H&E染色实验还表明CSTD.NHAc-DOTA(Gd)对小鼠没有明显的体内毒性。

图4. 瘤周注射CSTD.NHAc-DOTA(Gd)（a）或G5.NHAc-DOTA(Gd)（b）前后不同时间点的体内MR成像图和SNR统计图（c）。白色箭头指向肿瘤部位；注射的材料均溶解在PBS中，[Gd] = 5 mM，用量100 μL/每只。

  以上研究以“Core-Shell Tecto Dendrimers Enable Enhanced Tumor MR Imaging through an Amplified EPR Effect”为题，发表在美国化学会top期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.1c00262)上。东华大学化学化工与生物工程学院博士研究生宋聪为第一作者，东华大学史向阳教授、沈明武教授为共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委和中央高校研究生创新基金等项目的资助。

  文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.1c00262