免疫治疗因其在消除肿瘤和预防复发方面的强大作用，且与放疗、化疗等传统治疗方法相比而具备的更小的副作用、更长的疗效，已成为最受欢迎的肿瘤治疗策略之一。在机体发生抗肿瘤免疫反应的过程中，树突状细胞（DCs）作为一种抗原呈递细胞起着关键作用，它负责捕捉和处理肿瘤新生抗原，然后将处理后的抗原呈递给T细胞，进一步产生下游的T细胞免疫反应，杀死肿瘤细胞。一般来说，肿瘤患者体内有大量的新生抗原，但由于不能获得足够的、持久的抗肿瘤免疫反应，很难实现对肿瘤的彻底治愈。这主要是由于DC的免疫逃逸效应，限制了其有效的抗原呈递能力。研究发现，YTHDF1蛋白（RNA m⁶A甲基化的重要阅读蛋白）参与了DC相关的抗肿瘤免疫过程，其下调可以有效增强DC的肿瘤抗原交叉呈递能力，以便随后杀伤性T细胞浸润到肿瘤区域，提高抗肿瘤免疫效力。因此，DC中的YTHDF1蛋白被认为是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶标。

  呈现在T细胞或肿瘤细胞表面的免疫检查点分子也被认为是肿瘤免疫逃逸、限制内在的抗肿瘤免疫反应的关键。免疫检查点阻断（ICB）疗法被认为是提高治疗效果的一种有前途的策略。目前的免疫检查点分子主要包括与程序性死亡-1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）、吲哚胺2,3-二氧酶和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4相关的抗体和小分子药物。目前，PD-1或PD-L1抗体常用于ICB，以促进T细胞的杀伤效果。然而，单一使用PD-1或PD-L1抗体似乎并不能对许多癌症类型发挥出有希望的免疫治疗效果，因而有必要将其他治疗模式或元素与PD-1或PD-L1抗体相结合，以达到增强的肿瘤治疗效果。

  基于非病毒载体的基因治疗被认为是一种有效的肿瘤治疗模式。在众多非病毒载体中，聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子由于其独特的结构特点如三维立体结构、单分散性、易于表面修饰等，被认为是一种有前途的纳米平台。前期，东华大学史向阳教授团队利用功能化树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs）作为载体，可递送PD-1 siRNA至T细胞，用于调节免疫检查点抵抗T细胞衰竭（Gao et al., Adv. Healthcare Mater. 2021, 10, 2100833）；也可递送PD-L1 siRNA至肿瘤细胞，沉默肿瘤细胞表面的PD-L1表达，进而实现肿瘤模型的免疫检查点阻断治疗（Xue et al., Sci. China Mater. 2021, 64, 2045-2055）。鉴于此，团队尝试采用Au DENPs作为载体负载siRNA对DCs进行基因改造，从而增强其抗原提呈能力，实现增强的肿瘤免疫治疗。在本工作中，团队构建了一种两性离子和甘露糖（Man）修饰的Au DENPs用于沉默DCs的YTHDF1基因并联合抗体介导的ICB共同促进肿瘤免疫治疗。首先，团队将Man和1,3-丙磺酸（1,3-PS）部分修饰到第5代（G5）PAMAM树状大分子表面，进一步在其内部包裹纳米金颗粒得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-Man-PS₂₀} （MDNP）用于递送YTHDF1 siRNA（siYTH）至DCs内，以增强其熟化程度，从而提高肿瘤抗原的交叉提呈能力（图1）。

图1.MDNP合成示意图及其免疫治疗机制。

  团队首先在第五代树状大分子表面部分修饰Man使其具有良好的DC靶向性，随后部分修饰1,3-PS使其表面分布两性离子形成水化层而具备抗蛋白吸附性能，最后在其内部包裹纳米金颗粒以维持树状大分子的三维立体结构，进而增强载体的基因压缩能力。研究表明，合成得到的MDNP内部包裹的金核尺寸为1.8 nm，且尺寸分布均匀，具有良好的胶体稳定性和细胞相容性，能够高效压缩YTHDF1 siRNA，通过其抗蛋白吸附性能实现血清增强的基因递送。随后，通过体外实验研究了MDNP/siYTH复合物传递给DCs后的YTHDF1基因沉默效果，并同时评估了DCs表面CD80和CD86表达情况（图2A）。RT-qPCR和Western blot结果表明，与PBS、游离的siYTH或MDNP/siNC（阴性对照siRNA）复合物组相比，MDNP/siYTH复合物组的YTHDF1基因和蛋白表达都显著下调（图2B-D）。表明，MDNP载体可将siRNA传递给DCs，从而有效地抑制YTHDF1基因表达。流式细胞分析进一步证实MDNP介导的YTHDF1基因沉默可增强DCs的成熟度以激活下游免疫反应。如图2E所示，与其他组相比，经MDNP/siYTH复合物组处理的DCs表面的CD80和CD86的表达有明显上调。这表明，MDNP/siYTH复合物可以增强DCs的成熟度，可促进进一步的抗原交叉呈递。

图2. (A) MDNP/siYTH复合物被DCs吞噬后的机制作用示意图。(B）基于RT-qPCR检测的相对基因表达情况。（C-D）DCs经过不同处理后的YTHDF1蛋白表达水平。(E）流式细胞仪检测不同实验组处理的DC中CD80和CD86的表达结果。

  随后团队进一步探究了MDNP/siYTH复合物对B16肿瘤模型体内肿瘤免疫治疗效果（图3A）。如图3B所示，所有小组的小鼠体重都略有增加，这表明所有治疗组都无明显系统毒性。此外，结果显示MDNP/siYTH复合物和PD-L1抗体（aPD-L1）的联合治疗表现出最好的肿瘤抑制效果（图3C-J）。通过免疫荧光染色和流式细胞仪分析体内免疫细胞表达情况表明，MDNP/siYTH复合物组表现出良好的CD4+、CD8+ T细胞的肿瘤浸润效果，证明MDNP/siYTH 联合 aPD-L1的联合治疗能够明显地激活小鼠体内的免疫反应，增强体内的抗肿瘤免疫效应。

图3. (A) 小鼠体内治疗过程示意图。(B-H）不同时间段内小鼠体重及肿瘤体积变化。治疗第12天肿瘤切片的（I）TUNEL和（J）H&E染色结果。

  以上研究以“Genetic Engineering of Dendritic Cells Using Partially Zwitterionic Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles Boosts Efficient Tumor  Immunotherapy”为题，发表在美国化学会期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.1c01571)上。东华大学化学化工与生物工程学院博士研究生欧阳智俊为第一作者，东华大学史向阳教授和沈明武研究员为共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、上海市科委等项目的资助。

  论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.1c01571